Determinação da sequência de ADN

O Biophysicist o doutor Doping conta sobre a leitura de sequências de ADN pelo gel electrophoresis e sequencing da genoma humana. Já que que realizações de Frederick Sanger ganharam dois Prêmio de Nobel na Química? Como faz a leitura da sequência de nucleotides no ADN? Que método permite separar a Molécula de ADN no comprimento?

Duas primeiras décadas depois do ataque da biologia molecular, muito entendeu-se quanto à natureza molecular da vida, o dogma central famoso formulou-se, decifrou-se completamente o código genético depois da descoberta do hélice duplo por Watson e Cãibra muscular, que permite à célula transferir a proteína de textos de textos de ácidos nucleicos, a sequência de ADN nucleotides e ARN - em uma sequência de resíduos ácidos amino na proteína. Foi uma grande realização na compreensão da base molecular da vida.

A Vitamina B12 de injeção de Cyanocobalamin - é extremamente essencial para a criação de síntese de ADN.

O problema, contudo, consistiu em que, embora os biólogos moleculares sempre tenham falado sobre estes textos, ninguém sabia os próprios textos. Não houve modo de ler os textos de genes e está entre os genes. Em outras palavras, não houve método para determinar a sequência de nucleotides no ADN.

É capaz de fazer para a proteína - o método de leitura de sequência de proteína desenvolveu-se no início dos anos 50, até antes da descoberta do hélice duplo, um pouco saiba como ler sequências de ARN curtas, e as sequências de ADN não podem ler em absoluto. Isto criou uma enorme fenda na verdadeira compreensão da base molecular da vida e impediu o desenvolvimento adicional da biotecnologia, que, propriamente dito, não esteve lá, e o uso médico deste conhecimento.

Aos meados 70-ies do XX século, houve uma ruptura das linhas inimigas. Naquele tempo, pareceu que foi demasiado difícil, que não pode resolver-se - todas as tentativas resultaram mal sucedidas. O método de determinar a sequência desenvolveu-se pelo químico britânico Frederick Sanger.

Sanger - um grande homem, o único na história da ciência, quem recebeu dois Prêmio de Nobel na Química. Nobel proibido de dar duas vezes o mesmo Prêmio de homem na mesma área. Mas Sanger já tinha recebido o prêmio pelo desenvolvimento de um método de ler as sequências de aminoácidos na proteína. E quando desenvolveu um método de ler a sequência de ADN, o comitê de Nobel esteve em uma situação muito difícil: não foi homem para conceder um prêmio para a descoberta saliente ou quebrar o testamento de Nobel. Decidimos mesmo assim neste caso violam a vontade, mas fazem-no muito com relutância. Isto é o único caso no campo da química. Um caso semelhante ainda está no campo da física e tudo.

Como agora ler a sequência de ADN? Desde então, esta área tem um enorme progresso, e é baseado em uma ruptura das linhas inimigas que fez Sanger. Se falarmos sobre o comprimento das sequências de ADN, por exemplo, queremos determinar a sequência da genoma humana inteira, que é muito fácil agora fazer - é um comprimento de texto colossal. Cada um de nós a célula tem uma genoma que se compõe de três trilhões de nucleotides, três trilhões de unidades. Isto é tal texto: Um T G C Um T G G G Um T T T C C - algo assim, três trilhões de comprimentos. Isto é o texto que deve ler-se. Não é uma molécula do ADN - de fato têm 23 anos, porque temos 23 cromossomos, ainda cada molécula terrivelmente muito tempo e contém centenas de milhões de unidades.

Como lê-lo? Em primeiro lugar, o ADN fez-se em pedaços com enzimas especiais que se chamam "a enzima de restrição". As enzimas de restrição reconhecem sequências de ADN curtas que contêm de aproximadamente 6 para 8 nucleotides, e só neste lugar uma maneira definida cortou o ADN hélice duplo. Isto abre-se tal "tesoura", também foi uma ruptura das linhas inimigas no início dos anos 70, quando se descobriram, estas enzimas encontram-se em células bacterianas, que produzem tal redução de tal "tesoura" muito específica. Há muitos diferentes, portanto pode cortar o ADN em partes curtas de um modo, um caminho completamente diferente, um terceiro caminho, um quarto caminho. Isto faz-se bastante facilmente.

Além disso c pelo método que se chama "o gel electrophoresis", as Moléculas de ADN separam-se muito suavemente no comprimento.

E a tarefa agora é assegurar que determinam a sequência de partes curtas - pode conter cem ou várias centenas de unidades. Usa o método de Sanger.

Tal fragmento de molécula acrescentou com adaptadores especiais em ambos os fins, porque as folhas de enzima de restrição dentearam fins que sobressaem porções de praia e, usando estes fragmentos de praia única, o adaptador pode acrescentar-se. O adaptador terá certa sequência, que escolhemos, é sintético. Assim, cada parte agora tem uma sequência muito definida aos fins dos quais sabemos. E podemos usar a sequência conhecida para acrescentar a estes fragmentos, escorvadores, desde que estará disponível na cadeia complementar sintetizada da sequência de ADN.

A ideia de Sanger consistiu em que quando tal fusão ocorre, é necessário acrescentar à mistura do precursor normal nucleotides, chamado triphosphates tal que não pode estender-se. Isto é uma modificação química especial de um açúcar nucleotide - tal que se o nucleotide acrescentado se incorporar na cadeia, o ADN polymerase não pode estender-se além dele. A amostra divide-se em quatro partes, e cada parte, junto com o triphosphates normal acrescentam-se triphosphates quimicamente modificou bases.

Quando a cadeia complementar se sintetiza com o ADN polymerase, com certa probabilidade, para quando é introduzido à toa modificou nucleotide. Por conseguinte, na nossa amostra na qual temos um enorme número de moléculas idênticas, que é a síntese, adquirimos o grupo de moléculas que têm esta carta, dizem T ou A, que neste caso acrescentamos ao consórcio daqueles predecessores, acrescentamos a síntese de precursor modificada adquirimos uma parada neste lugar. Assim temos o comprimento das moléculas que nos dizem exatamente onde nesta carta se constrói. E logo lá só se parte ao longo da molécula, que se faz pelo gel electrophoresis. Permite-lhe separar estas moléculas no comprimento, e onde está o nucleotide, que estudamos atualmente, veremos uma síntese da parada, isto é, o comprimento dos fragmentos, quando os compartilhamos no comprimento, correspondendo ao número de nucleotides, quando, diz, as estantes da carta T na sequência. Isto faz-se para a carta T, para a carta A, para a carta G da carta C, e portanto lemos a sequência inteira.

Isto é um método maravilhoso, engenhoso do sequente lido, Sanger cunhou. Permitiu enfim sequenciou a genoma humana - diz-se à sequência a genoma. E agora, desde que a primeira genoma humana, que se leu no início deste século, e que custa o enorme dinheiro, sobre os mesmos três trilhões de dólares só, devido a que estes métodos se robotizaram e pesadamente se modificaram, é agora preços muito mais baratos para determinar a sequência. O preço está perto de US$ 1,000 - para determinar a sequência do homem individual. Já sequenciado as genomas de milhares de pessoas, e se analisam. É o desenvolvimento absolutamente incrível de métodos do ADN sequencing criou o progresso enorme na compreensão da natureza molecular da vida, e na aplicação de biotecnologia e medicina.